cambios de composición

son una de las principales características de la evolución del genoma. Con vistas a las diferencias entre las secuencias de nucleótidos composición puede inducir a error serio reconstrucciones filogenéticas. Variación composicional grande existe entre los miembros de la familia de Drosophilidae. Hasta ahora, sin embargo, las diferencias de la composición base se han descuidado en gran medida en las formulaciones de la sustitución de nucleótidos proceso utilizado para reconstruir la filogenia de este importante grupo de especies. El presente estudio adopta un máximo de verosimilitud marco de la inferencia filogenética con el fin de analizar cinco regiones de genes nucleares y muestra que (1) el patrón de composicional variación en el Drosophilidae no coincide con la filogenia de la especie, (2) que representa el heterogéneo contenido de GC con Galtier y Gouy modelo de sustitución de nucleótidos lleva a un árbol que difiere en aspectos significativos del árbol inferirse cuando las diferencias en la composición de nucleótidos son ignoradas, a pesar de que ambas hipótesis filogenética lograr un fuerte apoyo nodal en los análisis de rutina de carga, y (3) la corrección de distancia LogDet no puede superar por completo los efectos distorsionadores de la variación composicional que existe entre las especies de la Drosophilidae. Nuestros análisis con confianza colocar el género Chymomyza como un grupo afuera más cerca que la Scaptodrosophila género al género Drosophila y contundente apoyo a la monofilia de la Sophophora subgénero. Introducción secuencias homólogas de ADN de diferentes organismos con frecuencia difieren en su composición de bases de nucleótidos. No tomar en cuenta variación de nucleótidos composición de bases entre secuencias pueden conducir a mal árbol reconstruido topologías (secuencias de composiciones similares de base pueden convertirse erróneamente agrupados, Acero, Lockhart, y Penny 1993 ?que? < / a> ; Lockhart et al. 1994 ?que? ; Galtier y Gouy 1995 ?que? ) Y longitudes de rama que reflejan los cambios en la composición de nucleótidos en lugar de cambios en la tasa de sustitución (Tourasse y Li 1999 ?que? ). Contabilización de diferencias en la composición de nucleótidos entre secuencias es crítica para la valoración filogenético correcta. La familia Drosophilidae exhibe una variación amplia composición de nucleótidos (Rodríguez-Trelles, Tarrío y Ayala 1999 , 2000 a, 2000 b ?que? ; Tarrío, Rodríguez-Trelles, y Ayala 2000 ?que? ). A pesar de su importancia como modelo para los estudios evolutivos, aspectos significativos de la filogenia de esta familia siguen sin resolverse. Dos casos inestables implican taxones con contenido GC extremadamente bajas: (1) la posición relativa del género Chymomyza a los géneros Scaptodrosophila y Drosophila, y (2) la monofilia del subgénero Sophophora del género Drosophila. Morfológica (Throckmorton 1975 ? que? ; Grimaldi 1990 ?que? ) Y molecular (Kwiatowski et al. 1994 ? que? , Powell y DeSalle 1995 ?que? ; Tatarenkov et al. 1999 ?que? Encuestas) coinciden en que Chymomyza y Scaptodrosophila son parientes lejanos de los demás Drosophilids, pero la cuestión de que uno derivado anterior sigue siendo incierto. Debido a que son bien conocidos y fácilmente disponibles, estos dos linajes son a menudo utilizado como grupos externos a las de Drosophila (Powell 1997 ?que? ), Por lo tanto, saber cuál de ellos se originó primero es importante para la correcta evaluación de la plesiomorphy en este género. La monofilia de Sophophora está bien establecido sobre la base de la morfología (1975 Throckmorton ?que? ) Y en la evolución de las características estructurales de varios genes (Wojtas et al. 1992 ? que? ; ; Tatarenkov et al. 1999 ?que? ). Sin embargo, la determinación del estado monofilético de este subgénero del proceso de sustitución de las secuencias ha demostrado difícil de alcanzar. Los estudios moleculares característicamente lograr el apoyo de arranque débil para el nodo crítico (Kwiatowski et al. 1994 ?que? ; ; Russo, Takezaki, y Nei 1995 ?que? ; Remsen y DeSalle 1998 ?que? ; Kwiatowski y Ayala 1999 ?que? ; Tatarenkov et al. 1999 ?que? ), Con algunos estudios que la colocación de la willistoni (y su hermana clado saltans ) grupo de especies fuera del género Drosophila (Pélandakis y Solignac 1993 ?que? ). Las incertidumbres permanecen a pesar de un número creciente de regiones de nucleótidos incluidos en los análisis. sistemática molecular de la Drosophilidae se basa en la fuerza de apoyo de arranque para los nodos, pero prácticamente no se ha prestado atención a los modelos de sustitución empleadas para la reconstrucción de los árboles (aunque el tema es discutido por Whitfield y Cameron [1998] ?que? y del Acero, Huson, y Lockhart [2000] ?que? en relación con la evolución de los genes mitocondriales de ADNr en los insectos). Las grandes diferencias de nucleótidos composición que se producen entre los representantes de la familia se han descuidado en las formulaciones de los procesos de sustitución. La situación se agrava porque Ceratitis capitata , un miembro de la familia Tephritidae hermana, que se utiliza con frecuencia para el enraizamiento del árbol de la Drosophilidae, presenta una muy sesgada AT contenido. Parámetros adicionales potencialmente relevantes, tales como la variación entre los sitios de nucleótidos en sus las tasas de sustitución, también se han descuidado. id="p-5"> ( Adh ), la dopa-descarboxilasa ( Ddc ), glicerofosfato deshidrogenasa ( GPDH ), superóxido dismutasa ( Sod ), y xantina deshidrogenasa ( Xdh ). Demostramos que la contabilización de las diferencias de composición entre las secuencias de nucleótidos grandes produce una filogenia que difiere significativamente de las relaciones obtenidas cuando el contenido de GC heterogénea se omite en el modelo de sustitución. Sin embargo, las topologías obtenidas bajo las dos diferentes conjuntos de supuestos fueron estadísticamente muy apoyado en el arranque análisis. Nuestro estudio (1) favorece Chymomyza como el género hermana de Drosophila, con Scaptodrosophila derivado anterior, y (2) confianza coloca el willistoni grupo dentro del subgénero Sophophora. Materiales y Métodos Especies y secuencias Se investigaron 13 especies Drosophilidae, más C. capitata como un grupo afuera ( tabla 1 ). Hicimos una lista de Zaprionus, clasificado como un género por Wheeler (1981) ?que? , Como un subgénero Drosophila siguiendo Tatarenkov et al. (1999) ?que? , Pero aparece como un género Scaptodrosophila siguiente Grimaldi (1990) ?que? , Kwiatowski et al. (1994) ?que? , Y Tatarenkov et al. (1999, véase también Remsen y DeSalle 1998 ?que? ). Tabla 1 Las 14 especies estudiadas, con los números de acceso de GenBank para las secuencias de genes Tabla 1 da los números de acceso GenBank para las secuencias. El Xdh secuencias de Drosophila mimica y Drosophila busckii se obtuvieron recientemente para este estudio. Las estrategias para la amplificación, la clonación y la secuenciación se describen en Tarrío, Rodríguez-Trelles, y Ayala (1998) ?que? y Rodríguez-Trelles, Tarrío y Ayala (1999 ?que? ). Hemos sustituido una especie con otra en dos casos debido a la falta de disponibilidad: se utilizó Drosophila Bogotana (en lugar de Drosophila pseudoobscura ) para Ddc, y Chymomyza procnemis (en lugar de Chymomyza amoena ) para Adh. Estos intercambios no se espera que el sesgo de las conclusiones de nuestro análisis (ver Tatarenkov et al. 1999 < a id = "xref-ref-43-5" class = "xref-BIBR" href = "# ref-43"> ?que? ). secuencias fueron alineadas utilizando la opción predeterminada de CLUSTAL W, versión 1.5 (Thompson, Higgins, y Gibson 1994 ?que? ). Después de la eliminación de las brechas y columnas incompletamente determinada, la alineación del gen de cinco regiones codificantes abarcó 4.650 posiciones de nucleótidos: 513 de Adh, de 963 Ddc, de 747 GPDH, 342 de Sod , y 2.085 de Xdh. Hasta donde sabemos, este es el mayor número de regiones y personajes de nucleótidos empleadas conjuntamente para investigar la filogenia de la Drosophilidae. Los análisis estadísticos id="p-9"> ?que? ), Utilizando las opciones predeterminadas con las cinco regiones de genes agrupados juntos. Esta topología coincide con la que se muestra en la figura 3 a. Drosophila mimica y Dorsilopha ( busckii ), no mostrado en la figura, se colocan de acuerdo con la Adh + Sod + Xdh datos como los clados hermana a virilis - repleta y Zaprionus, respectivamente. La topología segundo representa las relaciones propuestas por Throckmorton (1975, véase hipótesis 1 en la tabla 4) sobre la base de los datos morfológicos. En Throckmorton (1975) ?que? esquema, D. mimica y Dorsilopha formar una tricotomía junto con Hirtodrosophila. Estas dos topologías son sustancialmente diferentes, el uso de otro árbol topologías razonable para ajuste del modelo no se espera que cambie los modelos de mejor ajuste identificadas en este estudio (Véase Yang 1994 ?que? ; Yang, Goldman, y el Viernes Santo de 1994 ?que? ). Se consideraron dos conjuntos de modelos anidados. Los modelos en un conjunto eran todas las formas especiales del calendario general reversible (GTR) Markov modelo de proceso (Tavaré 1986 ?que? ; Yang 1994 ?que? ), Lo que permite desiguales frecuencias de nucleótidos en el equilibrio (A ? C ? G ? T), y seis clases de sustitución (de transición de dos y cuatro tipos transversion). El modelo GTR asume que (1) el patrón de sustitución se ha mantenido constante a lo largo del árbol (Es decir, la premisa de uniformidad), y (2) todos los linajes exhiben la misma composición de nucleótidos (es decir, la premisa de la estacionariedad). Los modelos de la segunda serie son versiones anidadas del modelo de Galtier y Gouy (1998) (en lo sucesivo denotada T92 + GC). Este modelo se basa en Tamura (1992) ? que? (T92) la representación del proceso de sustitución, lo que permite una transición desigual y las tasas de transversion y GC ? AT (con G = C y A = T) en el equilibrio. (1998) Galtier y Gouy de aplicación del modelo T92 permite que la composición de nucleótidos para cambiar de rama en rama, asignando un equilibrio diferente parámetro contenido de GC para cada rama. El modelo no es ni homogéneo ni inmóvil, ya que el equilibrio GC contenido puede variar entre los linajes. Debido a que el modelo carece de reversibilidad, árboles tienen sus raíces. Entre los sitios de la tasa de variación fue acomodado en los modelos mediante el tratamiento de las diferencias de tipo entre los sitios como un efecto aleatorio usando la discreta distribución gamma (ocho con igual probabilidad categorías de tarifas, representado por la media) con parámetro de forma a (denotado como modelos DG). El valor de a es inversamente proporcional a la magnitud de la tasa de variación (Yang 1996 ?que? ). Los análisis se realizaron con el programa de BASEML PAML, versión 2,0 g (Yang 1999 ?que? ), Y el EVAL_NH y programas EVAL_NHG del paquete NHML (Galtier y Gouy 1998; Galtier, Tourasse y Gouy 1999 ?que? ). La relevancia de los parámetros específicos para describir la evolución de las secuencias se evaluó por medio de la probabilidad prueba de razón (Yang 1994 ?que? ; Huelsenbeck y Crandall 1997 ?que? ). Para una topología de árbol dado (por ejemplo, fig. 3 a ), un modelo (H 1 ) con p parámetros y logaritmo de verosimilitud L 1 se ajusta a los datos significativamente mejor que un submodelo anidada (H 0 ) con q = p - n Restricciones y probabilidad L 0> 1 < / sub> / L 0 ) = -2 (ln L 1 - log L 0 ) cae en la región de rechazo de una ? 2 n (donde n representa grados de libertad). Específicamente para la prueba de constancia tasa entre los sitios, donde el H 0 (a = 8) es equivalente a la fijación de a en el límite del espacio de parámetros del H 1 ( a <8), 2d sigue una mezcla 50:50 de ? 2 n -1 y ? 2 n distribuciones (Whelan y ?que? ). Para esta prueba, se utilizaron los valores críticos para el rechazo de la H 0 proporcionados por Goldman y Whelan (2000) ?que? . La variación de la secuencia de adición de parámetros pueden afectar la selección de mejor ajuste del modelo (Cunninghan, Zhu y Hillis 1998 ?que? ). Se tomó en cuenta esta posible fuente de sesgo mediante el ensayo de diferentes secuencias de adición de parámetros. Identificado mejor modelos se mantuvo la misma (resultados no mostrados). El modelo encontrado para describir satisfactoriamente el proceso de sustitución se utiliza para la generación de topologías de árbol candidato por el basada en la distancia vecino a participar (NJ) criterio. Las estimaciones del parámetro a forma utilizada en el cálculo distancia fueron los obtenida simultáneamente por la comparación probabilidad conjunta de todas las secuencias en la primera etapa, que puede ser considerado el más fiable (Yang 1996 ? que? ). NJ árboles se generaron utilizando el modelo que mejor se ajusta identificado por la prueba de razón de verosimilitud en el análisis de ML. Estadístico apoyo a los nodos de los árboles NJ se evaluó con el método bootstrap (nodos de contención que representan> 50% de los 1.000 bootstrap repeticiones; Felsenstein 1985 ?que? ). (1995) Galtier y Gouy de ?que? distancias gamma y los árboles NJ construido a partir de ellos se han obtenido con los programas GGG95 y SK, amablemente proporcionado por el Dr. Nicolás Tourasse. hipótesis filogenéticas derivadas de los análisis se compararon mediante el logaritmo de verosimilitud estima remuestreo (RELL) método de Kishino, Miyata, y Hasegawa (1990) ?que? (Tal como se aplica en PAML 2,0 g; Yang 1999 ?que? ). Para un determinado modelo de evolución, esta prueba proporciona una estimación de la significación de la diferencia entre la probabilidad de registro decenas de árbol candidato varias topologías. resultados Variación de la composición de nucleótidos en la Drosophilidae id="p-16"> ?que? , A diferencia de los enfoques alternativos, como la chi- cuadrado, este método tiene en cuenta las correlaciones filogenéticas posibles, por lo parece más apropiado. Estacionariedad de la composición de bases de nucleótidos fue rechazado claramente. Por separado, las cinco regiones desviado de estacionariedad ( P <10 -6 ) tanto cuando las secuencias completas fueron incluidos y cuando sólo posiciones de codón tercera se incluyeron en el análisis y, además, todos menos el GPDH y Sod regiones eran no estacionarias ( P <10 -4 ) en el primer y primer plus-segunda posiciones de codón. Cuando los cinco genes se combinaron, se estacionariedad fue rechazada ( P <10 -6 ) para primero, primero-más-segundo, tercero, y todas las tres posiciones de codón agruparon . Hemos demostrado que la composición de la base en la Drosophilidae es no estacionario. Ahora estamos interesados ??en el patrón de composición diferencias entre los taxones, ya que puede ayudar a identificar los posibles sesgos en reconstruido topologías provocada por la heterogénea composición de las secuencias. Figura 1 representa las relaciones inferidas de la composición de nucleótidos de la Adh , ddC, GPDH, SOD, y Xdh secuencias agruparon, teniendo en cuenta las tres posiciones de codón. Cladogramas similares se obtuvieron para el gen de cinco regiones analizaron por separado (resultados no mostrados). Debido a su bajo contenido de GC, Drosophila willistoni es repelido de sus subgéneros (es decir, Sophophora, representada en este acto por las especies ricas en GC Drosophila melanogaster y Drosophila pseudoobscura < / em>) y se asocia con el conjunto de Ceratitis taxones GC-pobres, Chymomyza y Hirtodrosophila. Scaptodrosophila, actualmente vieron como la representación de un género diferente (Grimaldi 1990 ?que? ; Kwiatowski et al. 1994 ?que? ; Tatarenkov et al. 1999 ?que? ), Grupos con especies (incluyendo el subgénero Drosophila) que exhiben intermedios contenido de GC. El contenido de GC de D. busckii y D. mimica, no se muestra en la figura, son también intermedios (50,3% y 51,0%, y 61,8% y 61,9%, en primera-plus-segundo y tercero en el codón posiciones, respectivamente, para DDC, Sod, y Xdh combinado). Las relaciones en figura 1 son fuertemente apoyados estadísticamente (por encima de los valores de arranque de los nodos están en o cerca de 100), lo que refleja la amplia GC diferencias de contenido entre los taxones. La topología sigue siendo el mismo después de excluir las posiciones de codón tercera, pero el apoyo de arranque (Valores por debajo de los nodos) se reduce, porque seguramente menor número de sitios que muestran sustitución parcial múltiple estén incluidos en el análisis. ACID; Lisergida; D-dietilamida del ácido lisérgico; METH-LAD; D- lisergamida, N, N-dietil, N, N-dietil-D-lisergamida; 9,10-didehidro- N, N-dietil-6-METHYLERGOLINE- 8b-carboxamida SÍNTESIS : Una solución de 6,7 g de KOH en 100 ml de H2O, bajo una atmósfera inerte y con agitación magnética, se llevó a 75 ° C, y 10 g de tartrato de ergotamina (ET) añadido. La mezcla de reacción se volvió amarilla como la ergotamina entró en solución en el transcurso de 1 h. La agitación se continuó durante 3 h. La mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente 10 ° C con un baño de hielo externo, y se acidifica a un pH de aproximadamente 3,0 mediante la adición gota a gota de 2,5 N H2SO4. Sólidos de color blanco comenzó a aparecer a principios de la neutralización; aproximadamente 60 ml de ácido sulfúrico se requiere. La mezcla de reacción se enfrió durante la noche, los sólidos se eliminaron por filtración, y la torta del filtro se lavó con 10 ml de Et2O. Los sólidos secos se transfirieron a un vaso de precipitados, se suspendió en 50 ml de amoníaco al 15% en etanol anhidro, se agitó durante 1 h, y se separó por decantación. Esta extracción se repitió, y la decantación original y el segundo extracto combinado y se filtra para eliminar unos pocos cientos de miligramos de sólidos no deseados. El filtrado claro se separó del disolvente a vacío, los sólidos residuales se disolvieron en 50 ml de 1% de amoniaco acuoso, y esta solución se acidificó como antes con 2,5 N H2SO4. Los sólidos precipitados se separaron por filtración y se lavó con Et2O hasta que esté libre de color. Después de secado bajo vacío hasta un peso constante, se obtuvieron 3,5 g de hidrato de ácido d-lisérgico, que se deben almacenar en un recipiente oscuro, sellado. Una suspensión de 3,15 g hidrato de ácido d-lisérgico y 7,1 g de dietilamina en 150 ml CHCl3 se llevó a reflujo con agitación. Con el calentamiento externo removido, se añadió 3,4 g POCl3 en el transcurso de 2 min, a una velocidad suficiente para mantener condiciones de reflujo. La mezcla se mantuvo a reflujo durante 5 min, en el que todo punto había entrado en solución. Después de volver a temperatura ambiente, la solución se añadió a 200 ml de 1 N NH4OH. Las fases se separaron, la fase orgánica se secó sobre MgSO4 anhidro, se filtró, y el disolvente se eliminó a vacío. El residuo se sometió a cromatografía en columna de alúmina con la elución empleando una mezcla 3:1 C6H6/CHCl3 mezcla, y la fracción recogida se separó del disolvente a vacío dura hasta un peso constante. Este sólido de base libre puede ser recristalizado a partir de benceno para dar cristales blancos con un punto de fusión de 87-92 ° C. IR (en cm-1): 750, 776, 850, 937 y 996, con el carbonilo a 1631. El espectro de masas de la base libre tiene un pico fuerte de los padres en masa 323, con fragmentos considerables en masas de 181, 196, 207 y 221. Esta base se disolvió en MeOH caliente, seco, usando 4 ml por g de producto. Se añadieron entonces seco d-tartárico (0,232 g por g de base de LSD), y la solución clara se trató con Et2O caliente gota a gota hasta que la turbidez no disipó en la agitación continuó. Esta opacidad ajustado en una suspensión cristalina fina (esto se consigue más rápidamente con la siembra) y la solución se dejó cristalizar durante la noche en el refrigerador. La luz ambiental deben ser severamente restringido durante estos procedimientos. El producto se separó por filtración, se lavó en poca cantidad con metanol frío, con una mezcla 1:1 MeOH/Et2O frío, y después se secó hasta peso constante. El producto cristalino blanco era tartrato de dietilamida del ácido lisérgico con dos moléculas de metanol de cristalización, con un punto de fusión de aproximadamente 200 ° C con descomposición, y se pesaron 3,11 g (66%). Recristalizaciones repetidas de metanol producido un producto que se convirtió progresivamente menos soluble, y, finalmente, virtualmente insolubles, como el aumento de la pureza. Una sal totalmente pura, en estado seco y cuando se agita en la oscuridad, emite pequeños destellos de luz blanca. DOSIS : 60 a 200 microgramos, por vía oral DURACIÓN : 8 - 12 hrs comentarios cualitativos : En el caso del LSD, parece presuntuoso intentar para seleccionar los comentarios típicos de cotización. Literalmente, miles de informes en la literatura, desde las primeras investigaciones exploratorias, para aplicaciones clínicas para el tratamiento del autismo, del alcoholismo o enfermedad mental, de ayudar en la psicoterapia y en el proceso de la muerte, a las aventuras de los militares en la inteligencia y químicas la guerra, a innumerables cuentos anecdóticos de placer y dolor. Decenas de libros se han dedicado a estos temas. EXTENSIONES Y COMENTARIO : El LSD es una molécula extraordinariamente frágil y algunos comentarios están en orden en cuanto a su estabilidad y almacenamiento. Como una sal, en agua, frío, y libre de aire y exposición a la luz, que es estable indefinidamente. Hay dos aspectos sensibles de su estructura. La posición de la fijación carboxamida, el 8-posición, se ve afectada por básico, o un pH alto, las condiciones. A través de un proceso llamado epimerización, esta posición puede trepar, produciendo dietilamida del ácido isolisérgico o iso-LSD. Este producto es biológicamente inactivo, y representa una pérdida de una cantidad proporcional de producto activo. Un segundo punto y separada de la inestabilidad es el doble enlace que se encuentra entre esta posición 8-y el anillo aromático. El agua o alcohol se puede añadir a este sitio, especialmente en presencia de luz (luz solar con su energía ultravioleta es notoriamente mala) para formar un producto que ha sido llamado lumi-LSD, que es totalmente inactiva en el hombre. Ah, sí, ya menudo pasado por alto, es posible que sólo una cantidad infinitesimal de cloro en el agua del grifo tratada, pero entonces sólo hay una cantidad infinitesimal de LSD en una solución de LSD típico. Y ya que el cloro destruirá LSD en contacto, la disolución de LSD en el agua del grifo no es apropiado. Hay muchos métodos sintéticos desarrollados y se informó para la preparación de LSD. Todos ellos comienzan con el ácido lisérgico, y por esa razón ha sido catalogado como una droga de la Lista III controlado, como un depresivo, bajo la ley federal. El lisergamida amida, un componente de diversas variedades de semillas de Morning Glory, es también una droga controlada y, por ley, un depresivo. Las primeras síntesis de LSD implicado la utiliza de una azida intermedia (el original proceso Hofmann, 1955), anhídridos mixtos con anhídrido trifluoroacético (1956) o con anhídrido sulfúrico (SO3-DMF en la sal de litio, 1959), con el agente de condensación de péptidos N , N'- carbonildiimidazol (1960), o con el cloruro de ácido como el intermedio activo con POCl3, PCl5 o cloruro de tionilo (1963) o simplemente oxicloruro de fósforo (1973). La mayoría de los métodos están defectuosos debido a la sensibilidad a la humedad excesiva, la generación de productos secundarios, o epimerización o inversión en el carbono 8-posición para formar d-iso-LSD. El procedimiento POCl3 es limpio y rápido, y es el proceso preferido hoy en día para la síntesis de una gran variedad de lysergamides sustituidos. El LSD término proviene de las iniciales del alemán para la dietilamida del ácido lisérgico, o Diethylamid Lysersäure. El número "25" que le sigue tiene muchos mitos que se le atribuye, como lo era la forma 25 de LSD que Hofmann intentado, o fue su intento de hacer del 25 al LSD. Desde mi propia experiencia con las compañías químicas que están aliados con las casas farmacéuticas, había supuesto que el nombre químico (que puede ser un bocado para el farmacólogo) fue simplemente reemplazada por un equivalente número de código pronunciable. Pero la respuesta es aún más simple. Hofmann, en su LSD, My Problem Child escribió: "En 1938, me produjo la sustancia 25a de una serie de derivados del ácido lisérgico:. Dietilamida del ácido lisérgico, LSD-25 abreviado para el uso del laboratorio ..." Dentro de unos años de el descubrimiento de la potencia extraordinaria de LSD, un gran número de análogos cercanos fueron sintetizados por Hofmann y sus aliados en Sandoz. Durante la siguiente década muchos fueron probados en humanos, tanto en pacientes como en sujetos sanos, con las descripciones cualitativas y dosis publicados en la literatura médica. Un número de análogos de LSD han mantenido el grupo dietilamida sin cambios, pero las adiciones o cambios se han hecho en el anillo de pirrol. - Indol-anillo sustituyente - en N-1 en C-2 código -H -COCH3 -CH3 -CH2OH -CH2N (CH3) 2 -H -H -CH3 -CH3 -H -H -H -H -H -Br -I -Br -I LSD-25 ALD-52 MLD-41 BOL-148 MBL-61 MIL ALD- 52. 1-acetil-N, N-dietilamida. Este material ha sido explorado en el rango de 50-175 microgramos y hay una serie de ensayos en humanos informó, con conclusiones variadas. Se encontró que hubo una menor distorsión visual que con LSD y parece producir menos ansiedad y era algo menos potente que el LSD. Otro informe decía que era más eficaz para aumentar la presión arterial. Sin embargo, otro no podía distinguirlos. ALD-52 sólo puede haber sido la droga que se vende como "Sunshine naranja" durante el "Verano del Amor" a finales de los '60 's. O "Sunshine Orange" puede haber sido, en realidad, el LSD. Este fue el tema de un ensayo fascinante en el que dos acusados ?? fueron acusados ??de distribuir LSD, mientras que afirmó que era ALD-52, que no era una droga ilegal. La fiscalía afirmó que a medida que se hidroliza fácilmente a LSD, para todos los efectos, que era LSD, y de todos modos, había que pasar por el LSD ilegal para llegar a ALD-52 por cualquiera de las síntesis químicas conocidas. Los acusados ??fueron declarados culpables. Y sin embargo, yo no sé quién ha medido realmente la velocidad o facilidad de esa reacción. Si ALD-52 se hidroliza fácilmente con el LSD, y el cuerpo es de hecho un instrumento hidrolítica, entonces estos dos fármacos debe ser absolutamente equivalente en todos sus detalles, lo que equivale cornezuelo de la psilocibina para psilocina argumento , excepto que esta es una acetamida en lugar de un éster de fosfato. MLD-41. 1- Metil-N, N-dietilamida. El homólogo 1-metil de LSD es tiene más de somática de efecto sensorial, tiene menos efectos visuales y está menos bien aceptado que el LSD, con el rango de dosis siendo 100 a 300 microgramos. Esto indica que es quizás un tercio de la potencia de LSD que está de acuerdo tanto con la dilatación pupilar y la acción refleja. Sin embargo, las respuestas cardiovasculares se incrementan realmente. Además de ser menos potente que el LSD, que parece tener un comienzo más lento pero se vive igualmente largo. Hay una tolerancia cruzada entre MLD-41 y LSD. BOL-148. 2-bromo-N, N- dietilamida. Este derivado del ergot sintético, junto con su homólogo de 1-metil MBL-61 (mencionada más abajo) se debe utilizar como herramientas potentes para estudiar el mecanismo de acción del LSD en el animal humano. No tiene efectos similares al LSD en el hombre. A los 6 a 10 miligramos por vía oral, hay algunos cambios mentales mencionados. Sin embargo, en otro estudio, se administró 20 miligramos al día para un sujeto durante 7 días, y no había efectos reportados. Y sin embargo, es tan potente como un agonista de la serotonina es LSD. ¿Cómo se puede argumentar la serotonina como neurotransmisor que desempeña un importante papel en la explicación de la acción de las drogas psicodélicas, cuando este compuesto es casi sin actividad. Hay algunas sugerencias de que una vía intravenosa puede ser más eficaz. He oído hablar de los efectos que se observó en un miligramo y tal vez una intoxicación corta (2-3 horas) después de 20 miligramos administrados durante un periodo de 20 minutos. Estuve involucrado desde hace muchos años en un estudio de radio-etiquetado BOL-148 que fue hecho por la bromación de LSD. Yo estaba bastante seguro de que el material presente sólo radiactivo fue BOL-148, pero bien podría haber sido un poco de LSD que no ha reaccionado todavía presente que, por supuesto, seguir siendo psicoactivas. La síntesis no está limpio - Tuve la tentación de hacer una entrada para este compuesto, si sólo para reproducir original de Albert Hofmann procedimiento publicado experimental. Se hace reaccionar 13,2 gramos de N-bromosuccinimida (en 400 ml de dioxano, con 1,2 litros de dioxano que contiene 25 gramos de LSD. Esto dio 11 gramos de producto bruto que tenía que ser recristalizado. Las síntesis radiactivos utiliza eficazmente bromo elemental, y dio rendimientos de 5 a 15%. Visualiza que la reacción! Una cálida frasco que contiene más de un litro de disolvente caliente en la que había no más de medio millón de dosis de LSD. 1-hidroximetil-LSD, 1- dimetilaminometil-LSD y 2-yodo-LSD. Estos tres compuestos adicionales se muestran aquí, ya que se han descrito en una ráfaga sintético que siguió al descubrimiento de la actividad de LSD. Pero en el momento en que no conocen ni sus códigos internos Sandoz ni si alguna vez habían sido exploradas en el hombre. Este es un tipo de frustrante catch-all entrada, en que el índice de tiempo vas a mandar aquí, y una vez aquí te das cuenta de que nada se sabe. Bueno, al menos los compuestos son conocidos, y tal vez hay algo en las bóvedas Sandoz que pueden ser interesantes. I no tienen acceso a ellos. MBL-61. 2- bromo-N, N-dietil-1-methyllysergamide. Este es el compuesto BOL-148 (mencionado anteriormente) con un grupo metilo unido al 1-posición del anillo de indol (LSD tiene un hidrógeno allí). Esto sería un reto aún más tentadora para la teoría de la serotonina para la actividad central de los psicodélicos, en que es sin ninguna actividad en el hombre a una dosis oral de 14 miligramos (similar a la inactividad de la BOL-61 compuesto, pero es unas cinco veces más potente que un agonista de la serotonina. Con él, como con el MIL análogo yodado, hay muchos ejemplos de comprometer la integridad científica en la búsqueda de fondos y reconocimiento. Ambos compuestos son efectiva como LSD en sí en el desplazamiento de LSD marcado que se enlaza a los receptores postsinápticos de serotonina en cerebro de los animales. Pero ninguno de ellos mostró ninguna actividad similar al LSD. Pero ambos se han marcado con 11 C o 122 I para dar formas emisores de positrones que puede administrarse al hombre y localizado en una tomografía por emisión de positrones instrumento (un escáner PET). Estaba en una reunión de una sección de estudio NIDA hace unos años, cuando alguien presenta algunos hallazgos con un grupo de sujetos que se quejaban de continuos problemas mentales supuestamente debido a la exposición LSD. Una carta fue puesta a mostrar el contorno del cerebro que muestra la ubicación de los focos EEG que se observaron en uno de estos temas. Al lado se trataba de un estudio de PET que muestra la distribución de LSD radiactivo en un sujeto. El propósito era discutir las similitudes y diferencias de las coordenadas de la actividad eléctrica y la concentración de radioisótopos. Yo inocentemente le preguntó qué isótopo de positrones se había utilizado, ya que no sabía de ningún etiquetado de positrones con éxito de LSD. Carbono 11, me dijeron. Cuando en la molécula fue el marcador incorporado, le pregunté. En el grupo de 1- metil posición. Se reconoció finalmente que el compuesto que se habían utilizado fue 2-yodo-1-metil-LSD, nuestro compuesto MIL , que es un mundo muy diferente. Un farmacólogo podría decir que son similares en acción (mirando a la serotonina no, la acción psicodélico) y un químico podría decir que son de estructura similar (mirando a la parte superior del 80% de la molécula. Pero son compuestos diferentes. Ésta es una forma más sutil de engaño. Es, de hecho, hacia fuera y hacia fuera deshonesto, pero se ve bien ahí arriba en la pantalla en una conferencia. Voy a mencionar de pasada que hay tres posibles estereoisómeros para. d-LSD Hay d-iso-LSD, LSD-l, y l-iso-LSD. La inversión de la estereoquímica del grupo adjunto diethylcarboxyamido de d-LSD da el diastereoisómero (d-iso- LSD) que es una impureza frecuente sintético de la misma d-LSD La óptica correspondiente antípodas LSD l-y l-iso-LSD también son conocidos y han sido probado Los tres son completamente inactivos:.. d-iso-LSD no muestra cambios psicológicos en una dosis oral de 4 miligramos, l-LSD ninguno de hasta 10 miligramos por vía oral;. y l- iso-LSD ninguno en 500 microgramos por vía oral Estas disminuciones dramáticas en la potencia mostrar tanto la estereoselectividad de la molécula de LSD nativo en la producción de sus efectos centrales y el LSD libre de pureza de estos isómeros. La segunda ubicación principal de las variaciones en la estructura del LSD ha sido en la naturaleza de los grupos alquilo sobre el átomo de nitrógeno de la amida. Algunos de éstos son síntesis Sandoz, algunos son de otros grupos de investigación, y algunos de ellos se encuentran en la naturaleza. Algunos de estos se han estudiado en el hombre, y algunos no. Algunos de los compuestos de embrague original Sandoz tener ambos 1- sustituyentes y amida de alquilo (R) las variaciones del grupo: indol --- Sustituyentes del nitrógeno de amida --- R = R = R = nombre en clave -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -H -CH3 -CH3 -COCH3 -CH3 -H -CH3 - CH2CH3 -(CH2)2CH3 -CH(CH3)CH2OH -CH(CH3)CH2OH -(CH2)CH3 -CH(CH3) CH2CH2OH -(CH2)4CH3 -CH(CH3)CH2CH2CH3 -CH(CH2CH3)2 -(CH2)5CH3 -CH (CH3)CH2CH2CH2CH3 -(CH2)6CH3 -CH(CH3)CH2CH2CH2CH2CH3 -CH3 -CH2CH3 - (CH2)2CH3 -CH(CH3)2 -CH(CH3)CH2C6H5 -CH2CH3 -(CH2)2CH3 -(CH2)2CH3 - CH(CH3)2 -CH2CH=CH2 -(CH2)2CH3 -CH2CH2CH2CH2- -CH2CH = CHCH2- CH2CH2CH2CH2CH2-- --CH2CH2OCH2CH2 -CH2CH3 -CH (CH2CH3) CH2OH -COCH3 -CH2CH2CH2CH2- -H -H -H -H -H* -H -H* -H* -H -H* -H -H -H* -H -H* - CH3 -CH3 -CH3 -CH3 -CH3* -CH2CH3 -CH2CH3 -(CH2)2CH3 -CH(CH3)2 - CH2CH=CH2 -(CH2)3CH3 -H -H* -CH2CH3 LA-111 -32 LAE Ergonovine Methergine DAM-57 LÁMPARA LSD-25 DAL LPD-824 LSM-775 MLA-74 UML-491 -10 ALA MPD-75 En las amidas marcados con "*" no ha sido la introducción de un nuevo centro asimétrico, que por supuesto se duplica el número de isómeros que es posible. En cada caso las dos formas ópticas resultantes se prepararon por separado, y evaluados por separado en cuanto a su farmacología. Este listado no pretende ser exhaustivo, pero se muestra para sugerir la cantidad de esfuerzo sintético que se ha realizado hacia la exploración y entendimiento de la alta potencia asociada con estos dos grupos etilo extraordinariamente importantes en el nitrógeno de la amida de LSD. Le he dado los nombres en clave Sandoz, de nuevo, por lo que yo los conozco. Aunque ninguno de ellos realmente justifican una receta específica, hay suficiente en animales y humanos informó de farmacología para justificar enumerarlos a continuación por separado. La mayoría de estos informes aparecieron en la década de mediados de 1950, pero algunos estudios se siguen haciendo y siendo trabajos son publicados también hoy con nuevas ideas, pero, por desgracia, sólo con la farmacología animal. He sido tan culpable como cualquiera que haya tratado de montar todos estos compuestos en una tabla con una "potencia humana" factor que los compara directamente con el LSD. Esta es una simplificación incómodo. Estas son las observaciones reales notificados, y voy a dejar que el lector proporcionar su índice propia potencia. LA-111, ergina, d-lisergamida. Este es un compuesto activo y se ha establecido como un componente importante en las semillas de morning glory. Se ensayó la actividad humana, por Albert Hofmann en auto-pruebas de nuevo en 1947, mucho antes de que esto era conocido por ser un compuesto natural. Una administración intramuscular de una dosis de 500 microgramos llevado a un estado cansado, soñadora con la incapacidad de mantener pensamientos claros. Después de un corto período de sueño, los efectos se han ido y línea de base normal se recuperó en cinco horas. Otros observadores han confirmado esta obnubilación de la conciencia que lleva a dormir. El epímero, invertida en C-8, es isoergine o d isolysergamide-, y también es un componente de semillas de gloria de mañana. Hofmann intentó una dosis de 2 mg de la amida, y como con ergina, experimentó nada más que cansancio, apatía, y una sensación de vacío. Ambos compuestos son probablemente correctamente despedido por no ser un contribuyente a la acción de estas semillas. Es importante señalar que ergina, así como el ácido lisérgico sí mismo, se muestra como una droga de la Lista III en la Ley de Sustancias Controladas, como un depresor. Esto es, con toda probabilidad, una estratagema para controlarlos como precursores lógicos de LSD. LAE-32, N- ethyllysergamide. Diferentes personas han observado y reportado efectos diferentes, con diferentes vías de administración. Administraciones subcutáneas de 500 a 750 microgramos se han dicho para producir un estado de apatía y sedación. Los estudios clínicos con dosis de 500 microgramos im se sentía a ser menos eficaz que el uso de control de 100 microgramos de LSD. Y, sin embargo, las dosis orales de dos veces esta cantidad, 1,6 miligramos, se han dicho para producir una corta vida como el LSD-efecto con ninguno de estos aspectos negativos. LPD-824, N-Pyrrolidyllysergamide. Cinco ensayos con una dosis de 800 microgramos por vía oral llevado . hasta la comunicación de un efecto fugaz que era similar a una décima parte de esta cantidad de LSD . LSM-775, N-Morpholinyllysergamide Hay informes contradictorios, uno establece que 75 microgramos es una dosis eficaz, comparable a una dosis similar de LSD, y el otro declaró que entre 350 y 700 microgramos, fue necesaria para provocar esta respuesta, y que había menos signos de estimulación cardiovascular y toxicidad periférica. DAM-57, N, N-Dimethyllysergamide. Este compuesto indujo alteraciones autonómicas en niveles orales de algunos diez veces la dosis requerida para el LSD, presumiblemente en los altos centenares de microgramos. Hay un cierto desacuerdo en cuanto a si se produjeron cambios psíquicos observados. DAL, N, N- Diallyllysergamide. Como la sal tartrato, no es en el mejor un toque de brillo visto en 600 microgramos por vía oral, pero hay una sedación también se informó. Sin duda, es un orden de magnitud menos potente que el LSD en sí. UML-491, metisergida, Sansert. Este es el homólogo sintético de metergina (1-metil) y se emplea clínicamente como un tratamiento para la migraña. Cuando la dosificación terapéutica habitual de dos miligramos se escala por un factor de diez, existe una profunda LSD-respuesta como se describe por la mayoría de los sujetos. Un número de estos análogos de cornezuelo de centeno de la naturaleza pueden ser considerados como precursores potenciales de la preparación de LSD. Pero aquí hay un grupo 1-metil que efectivamente conectado permanentemente, por lo que no se puede jugar este papel. La ubicación de la tercera modificación estructural de la molécula de LSD ha sido en el 6-posición en el anillo D. Esta es la serie LAD con cualquiera de los varios grupos alquilo unidos al átomo de nitrógeno. El grupo metilo se encuentra con LSD en sí, y es razón para usar METH-LAD en el título como un sinónimo. Las sustituciones de etilo, alilo y propilo proporcionar ETH-LAD , AL LAD- , y LAD-PRO , y cada uno de estos comandos de una entrada separada. El precursor más frecuente para la fabricación de LSD es ergotamina, un alcaloide principal del mundo del cornezuelo de centeno. Es totalmente desconocido en las glorias de mañana. La forma comercial usual es la sal de tartrato, y se refiere a menudo bajo la abreviatura código de ET, para el tartrato de ergotamina. Se ha encontrado un uso médico en el tratamiento de dolores de cabeza por migraña y como oxitócico Care (un agente que se utiliza en el parto para estimular las contracciones uterinas con la terminología ET debe ser tomada, en que en el mundo de la droga que tiene dos asociaciones adicionales.; ET-una para el alfa-ethyltryptamine y NET para N- monoethyltryptamine. ergonovina es una forma natural, soluble en agua alcaloide del cornezuelo de centeno, que se encuentra en los preparativos del cornezuelo ambos y en muchas especies de semillas de morning glory, y hay varios informes de LSD-como la acción en los niveles orales de entre dos y diez miligramos. Esto tiene un uso importante en obstetricia, de nuevo como un oxitócico, aproximadamente una décima parte de la dosis. Este potencial farmacológico debe ser respetado en los ensayos psicofarmacológicos. El homólogo de un carbono (el lugar butanolamide que el propanolamide) se llama metergina o metilergonovina. Es un aliado sintético y es eficaz por vía oral como un oxitócico a una dosis de 200 microgramos. También tiene una acción similar al LSD menos diez veces este nivel. Aunque hay muchos otros tesoros químicos en el mundo ergot, me gustaría terminar este comentario con una vuelta al tema de las semillas de morning glory. Cuatro alcaloides adicionales del cornezuelo del mundo debe ser reconocido como potencialmente factores que participan en la historia de MGS. Con cada uno de estos, el sistema de ergolina anillo primario es en gran parte intacto, pero la función amida se fue completamente. El grupo carboxilo se ha reducido al alcohol para dar elimoclavina. Existe la presente molécula relacionada que es el isómero con el doble enlace se trasladó a conjugarse con el aromático anillo, se llama lisergol No es la misma molécula, pero con un grupo hidroxi unido al átomo de carbono 8-posición (una etilenglicol!);.. se llama penniclavine Y, por último, que la D-anillo en realidad se puede abrir entre el 5 y 6 posiciones, para darnos un derivado de amina secundaria triptamina, chanoclavine. Para ser completamente anal retentivo en este inventario Ipomoea, debe hacerse mención de cinco alcaloides que se encuentran presentes en cantidades traza verdaderamente, todos los cuales no tienen átomos de oxígeno presentes en alguna que la sustitución en la posición 8-ergolina. Estos son los 8-metil isómeros agroclavina, setoclavina, festuclavine y cycloclavine, y la lysergene metileno analógica. Estas estructuras en efecto definir oscuridad absoluta, y muy probablemente no contribuyen al estado mañana intoxicación gloria . Pero los otros, algunos de los presentes se montos considerables, algún día podría ayudar a explicar por qué la farmacología de estas semillas es muy diferente a la de las cepas principales, los ergines. fig. 1.-Las relaciones, según se difiere la composición de nucleótidos de la Adh , DDC, GPDH, Sod, y Xdh las regiones de genes agrupados juntos. El cladograma fue obtenida con el algoritmo vecino de unirse sobre la base de las distancias euclidianas entre las frecuencias de nucleótidos para cada par de taxones utilizando las tres posiciones de codón. Los porcentajes de contenido de GC en el primer segundo-más- y en tercer codón posiciones, respectivamente, se les da. Los números en los nodos son los valores de porcentaje de bootstrap (basado en 100 pseudoreplications) teniendo en cuenta todos los sitios (arriba) o solamente las posiciones primera-más-segundo de los codones (abajo), respectivamente. Contenido de GC en las posiciones tercera disminuye monótonamente desde la parte superior (+ GC) a la parte inferior (-GC); una tendencia leve en la misma dirección puede ser visto por primera-más-segundo posiciones ajuste del modelo para los datos de secuencia fija considerados en este estudio el proceso de sustitución de nucleótidos Tabla 2 muestra los valores de probabilidad de registro estadístico de razón para modelos obtenidos asumiendo la topología de trabajo primero (ver Materiales y Métodos ), por separado para cada región del gen, y para las cinco regiones de genes agrupados juntos. Excepto para la comparación de Kimura (1980) ?que? dos parámetros modelo frente a Tamura (1992) ?que? modelo, modelos anidados son siempre rechazados cuando se contrasta con el modelo completo que viene. Todos los conjuntos de datos (incluyendo el DDC + Sod + Xdh conjunto de datos, no se muestra en la tabla) se describen mejor con el no estacionario homogéneo T92 + dG + GC modelo, que permite dos tipos de sustitución (transiciones y transversions), discretos gamma- distribuido tasas en todos los sitios (componente dG), y GC contenido variable entre los linajes (componente GC). La mejor representación homogénea estacionaria del proceso de sustitución se alcanza con el modelo GTR + dG (resultados no mostrados). T92 + dG + GC y GTR + dG son modelos nonnested, por lo que su familiar ajuste no se puede evaluar por chi-cuadrado. El T92 + dG + modelo GC produce mayor puntuación de probabilidad que el modelo GTR + dG en todos los casos (-3,785.8 -3,809.7 Vs, vs -6,536.9 -6,572.8, -3,960.1 -3,971.9 vs, vs -2,635.5 -2,662.7, -15,942.9 -16,102.3 vs, y -29,730.7 -29,894.9 Frente; las puntuaciones de probabilidad log producidos por T92 + dG + GC vs GTR + dG para Adh, DDC, GPDH, Sod, Xdh, y el conjunto de datos combinados), lo que evidencia la importancia de dar cuenta de las diferencias de composición de nucleótidos entre linajes. Los resultados no cambian cuando ajuste del modelo se realiza suponiendo que la topología propuesta por Throckmorton (1975, primera topología En el cuadro 4, los resultados no se muestra), lo que refuerza las conclusiones de otros estudios (por ejemplo, Yang 1994 ?que? ; Yang, Goldman, y el Viernes Santo de 1994 ?que? ), Lo que indica que, en general, las diferencias de topología de árboles tienen sólo un efecto menor en la selección del modelo. En cualquier caso, lo que debería que tener en cuenta que el registro de valores de probabilidad prueba de razón se muestra en tabla 2 se obtuvieron con una topología resultante de la utilización de métodos filogenéticos que son estacionarias (ver Materiales y Métodos ), por lo tanto, sería de esperar que cualquier sesgo que pueda existir debido a la adopción de esta topología para el modelo adecuado debe ocurrir en una dirección que favorece la modelo GTR + dG. Tabla 3 muestra las estimaciones de la a parámetro de forma de la distribución gamma discretos para los diferentes conjuntos de datos obtenidos con la T92 + dG, la T92 + dG + GC, y los modelos de GTR + DG suponiendo la primera topología de trabajo. Los tres modelos de producir básicamente los mismas estimaciones, con la T92 + dG + modelo GC producir un poco más grandes valores de a que los otros modelos. En general, el valor de a parece ser bastante sensible al número de tipos de sustitución de nucleótidos y los parámetros de frecuencia incluidas en el modelo. Diferencias de la tasa de sustitución de un sitio a otro son mayores para GPDH y Ddc (a valores más bajos), lo que sugiere que estos loci están sujetos a fuertes limitaciones funcion Consejos para la síntesis de oligonucleótidos Richard T. Pon - Universidad de Calgary La síntesis de oligonucleótidos es de lejos el más común de servicio ácido nucleico proporcionada por las instalaciones básicas. La química y la instrumentación requerida ha sido ampliamente optimizado, y los resultados excelentes se pueden obtener en casi cualquier persona con un sintetizador de ADN y reactivos de buena calidad. En efecto, la síntesis de cortos (menos de 40 nucleótidos) sondas y cebadores se ha vuelto tan fácil que no experiencia especial, aparte de la capacidad de leer el manual del operador se requiere, y un operador a tiempo parcial con un sintetizador de columna de ADN de una sola o doble puede manejar las exigencias de un grupo pequeño. Sin embargo, las instalaciones de servicios básicos deben ser capaces de hacer miles de secuencias y hacerlo de forma rápida, fiable y económica, y esto requiere un poco más habilidad y experiencia. Además, algunas instalaciones básicas, como el mío, se le puede pedir a preparar las secuencias que son más difíciles que las sondas habituales y cebadores. Creo que hay dos maneras buenas instalaciones de servicios básicos pueden distinguirse de las operaciones de síntesis más pequeños, como el sintetizador de laboratorio individual. En primer lugar, los servicios básicos debe ser capaz de hacer un gran número de secuencias de alta calidad y sin errores. En segundo lugar, el servicio debe ser capaz de manejar "difíciles'' peticiones, tales como secuencias largas o modificaciones de secuencias que pueden estar fuera del alcance de las operaciones más pequeñas. En este artículo me gustaría presentar algunas sugerencias que pueden ayudar a cumplir con estos criterios, así como ayudar a los que pueden encontrarse con dificultades con sus síntesis. Por favor tenga en cuenta que estas son sólo sugerencias y no todas las instalaciones se encuentran ellos es necesario o deseable. Sin embargo, todos ellos han demostrado ser útiles en mi laboratorio, que se especializa en la preparación de oligonucleótidos difíciles y desarrollo de la metodología sintética. Ver fosforamiditas para el acoplamiento Eficiencia Fosforamiditas son los reactivos más importantes, y los buenos resultados no se pueden obtener con los lotes que no han sido cuidadosamente purificados o almacenado libre de humedad. Durante los últimos nueve años, nuestro laboratorio ha comprobado un montón fosforamidita para acoplar eficiencia antes de liberarlos para uso general. Esto se debe a que hemos observado diferencias significativas en la capacidad de acoplamiento entre los diferentes lotes y en ocasiones han encontrado muchas que han tenido que ser rechazado de plano por tanto el rendimiento de acoplamiento pobre (menos del 98%) o problemas de solubilidad. Lote a lote variabilidad ha mejorado en los últimos años, pero las instalaciones básicas deben ser conscientes de que diferentes lotes no son siempre iguales. En nuestro laboratorio se prueba cada lote fosforamidita mediante la preparación de una secuencia de bases 12 de largo que contiene solamente esa base. Los colores tritilo de cada etapa de acoplamiento se recogen y se cuantificaron cuidadosamente usando un colorímetro o espectrofotómetro (no una en línea tritilo monitor), y el rendimiento de acoplamiento medio es calculado. Debido a que este ensayo se ocupa de los cambios relativamente pequeños en la eficacia de acoplamiento, es muy importante que las mediciones de precisión realizado tritilo, otros reactivos que ser fresco, y la instrumentación está funcionando correctamente. Esto nos permite determinar la eficiencia de acoplamiento promedio de un lote específico en nuestras condiciones y en nuestro propio sintetizador. La mayoría de los fabricantes de la prueba para el acoplamiento de capacidad, pero estos métodos varían y creo que la única prueba que importa es el hecho en su propio instrumento. También es posible que los rastros de humedad introducida en la etapa de envasado o manejo inadecuado durante el transporte puede afectar a la eficiencia de acoplamiento final. La eficacia de acoplamiento promedio de un buen lote debe ser mayor de 98,5%, con preparaciones muy buenos productores de los rendimientos medios de mayor que 99%. Muchos productores de rendimientos de acoplamiento menos de 98,0% no son aceptadas. Debido a una mayor eficiencia de acoplamiento de producir un rendimiento general más alto, utilizando un bien o mejor que el promedio del lote puede mejorar significativamente la calidad del oligonucleótido. Esta diferencia puede no ser perceptible con oligonucleótidos cortos, pero el efecto se hace más pronunciado a medida que aumenta la longitud de la cadena, y el rendimiento general más alto puede determinar si una secuencia funcionará sin purificación ni si una larga secuencia puede ser aislada. En el pasado, he pedido que los fabricantes de enviarme muestras de lotes específicos para la aprobación previa antes de comprar. De esta manera, he podido seleccionar sólo los mejores lotes fosforamidita, y por lo general se compra un año de suministro de una sola vez (no hay pérdida de actividad al almacenar fosforamiditas en el congelador durante este período de tiempo). Sin embargo, dado que los métodos de producción parece haber mejorado en los últimos años, ya no siento que la prueba antes de la compra es necesaria. Nosotros, sin embargo, continúe revisando cada nuevo lote que llega. Si bien esto puede no ser necesario para aquellas instalaciones que hacen de secuencias breves, te recomiendo esta prueba para aquellas instalaciones que tienen dificultad con oligonucleótidos largos o para aquellos que quieren producir consistentemente el mejor material posible. Supervisar el rendimiento del sintetizador con el análisis de tritilo El catión tritilo de color naranja producido por el grupo dimetoxitritilo en la protección de ácido proporciona un método conveniente para la determinación cuantitativa de la eficiencia de acoplamiento. Esto es debido a la relación de uno a uno entre el número de moléculas de tritilo y el número de enlaces fosfato nuevas formadas. Por desgracia, la naturaleza cuantitativa de esta medida ha sido rechazada por algunos como sólo "aproximado". Esto podría ser debido a dos factores. En primer lugar, los primeros soportes CPG contiene incorrectamente bloqueados funciones de superficie que podrían llevar a la formación de nuevas cadenas de oligonucleótidos y aparentes tritilo "rendimientos" de más de 100% (1). Sin embargo, los actuales soportes de CPG y poliestireno (2) ya no tenemos este problema. En segundo lugar, algunos instrumentos no reproducible entregar todo el catión tritilo en el colector de fracciones y por lo tanto las mediciones tritilo no son exactas. En mi trabajo pasado, desarrollar tanto la síntesis de instrumentación y reactivos, he encontrado que la recolección de cuidado y medición de colores tritilo es un ensayo fiable de la eficiencia de acoplamiento. Análisis tritilo, sobre una base diaria, es importante para una instalación de síntesis de núcleo, ya que proporciona una indicación temprana de lo bien que las reacciones de acoplamiento están avanzando. Aunque los resultados de tritilo no puede detectar problemas con la oxidación pobre o pasos de tapado, que se advierten de los problemas de contaminación con humedad, los reactivos de acoplamiento pobres, bloqueado o parcialmente líneas enchufado, y una variedad de otros mal funcionamiento del instrumento. Además, si la secuencia correcta se ha introducido en el sintetizador y el número correcto de buenos colores tritilo ha sido verificado, entonces uno puede estar seguro de que la secuencia correcta se ha hecho y sólo una imagen del gel o cromatograma que confirma la homogeneidad de secuencia (es decir, corregir taponado y oxidación) se requiere para la documentación completa de control de calidad. La simple inspección visual de los colores tritilo puede alertar a un operador a una avería inmediata y absoluta, sino sólo medidas cuantitativas pueden detectar pequeñas reducciones en el rendimiento del instrumento. En una instalación de ocupado, es importante detectar estos fallos tan pronto como sea posible a fin de evitar demoras o la producción accidental de un gran número de oligonucleótidos problema. Desafortunadamente, sin embargo, un análisis preciso de tritilo en un espectrofotómetro es demasiado laborioso para uso rutinario por cualquier facilidad de la base, y por lo tanto, una variedad de otros métodos para el análisis de tritilo, que son más fáciles aunque menos precisa, se han desarrollado. Me gustaría describir cómo nuestro laboratorio utiliza tres de estos métodos alternativos para el análisis de tritilo en nuestras operaciones de síntesis de rutina. Estos se describen en orden creciente de complejidad y precisión. El primer método, hemos utilizado, es la opción AutoAnalysis disponible en Applied Biosystems 392/394 sintetizadores de ADN (3). Esta opción consiste en detectores de conductividad individuales (una por columna) que miden la cantidad de catión tritilo cargada que fluye fuera de cada columna de síntesis. El monitor ABI es fácil de usar, ya que está integrado en el sintetizador. Sin embargo, es caro y no informa de los rendimientos de acoplamiento para cada paso individual (aunque se mide y calcula ellos). En su lugar, un rendimiento medio por pasos, que enmascara los rendimientos individuales de la en un valor promedio, se presenta para cada paso. Esto hace que sea difícil de descifrar el rendimiento real de la máquina y por lo que el detector está limitada a la detección de fallos bastante severas. Un detector más preciso, la TritylTech en línea detector tritilo, está disponible de Ana-Gen Tecnologías (4) y se puede conectar a casi cualquier sintetizador de ADN, incluyendo el ABI 380A / B serie. Este detector emplea el método colorimétrico más convencional para medir colores tritilo pero difiere del flujo a través de detectores de tritilo utilizados por Pharmacia, Milligen y otros proveedores (I no han evaluado cualquiera de los sintetizadores no ABI) mediante el uso de hasta cuatro cubetas de cuarzo a recoger los colores tritilo. Las mediciones de color sólo tiene lugar después de que los colores enteros han sido recogidos, parcialmente diluida, y se mezcla. Acoplamiento de datos se presenta en un formato claro y fácil de entender (rendimientos por ciento por etapas y en general), y el monitor es capaz de detectar acoplamientos que son sólo unos pocos puntos porcentuales inferior a la normal. Sin embargo, el detector no está integrado con el sintetizador y requiere un controlador de PC separada que debe ser configurado antes de cada síntesis. Obtención de una copia impresa de los resultados es difícil porque el monitor utiliza una conexión de puerto paralelo para la adquisición de datos en lugar de un puerto serie, y el tiempo requerido para eliminar las cubetas de cuarzo añade casi un minuto para cada ciclo de acoplamiento. El tercer método más antiguo y de análisis tritilo empleados en nuestro laboratorio es el que más tiempo pero ofrece una precisión similar a un espectrofotómetro. Este método utiliza una PC-800 de fibra óptica "sonda de inmersión" colorímetro de Brinkmann Instruments (5), lo que elimina la necesidad de transferir cubetas dentro y fuera de un espectrofotómetro. Esto hace que las mediciones mucho más rápido, aunque todavía no automatizado. Utilizamos esta técnica para medir los resultados de nuestra 380B mayores y los sintetizadores de ADN 38lA por: a) la recogida de los colores de tritilo en tubos de 12 ml, b) diluir los tubos a un volumen constante (aproximadamente 7-8 ml) con 5% de ácido dicloroacético / 1,2- dicloroetano mediante un dispensador de botella superior, c) agitación en vórtex, y d) la inmersión de la sonda de fibra óptica en cada tubo para medir la absorbancia. O bien un 470 nm o 545 nm filtro se utiliza en el colorímetro para que la lectura de la absorbancia será dentro del alcance. Solemos medir sólo los tres primeros y los tres últimos colores tritilo, a menos que esté probando nuevos reactivos, procedimientos sintéticos o solucionar un problema, en cuyo caso se comprueba cada etapa de acoplamiento. Este método es probablemente el método menos costoso y más eficaz para aquellas instalaciones que sólo lo desea, puede realizar el análisis de tritilo ocasional. Por último, también ha habido un método semi-automatizado (6) descrito que utiliza un lector de placas de 96-pocillos, que podría ser de interés para los laboratorios con un lector de placas existentes. Sin embargo, este método no ha sido evaluado en nuestro laboratorio. La actual generación de detectores automáticos tritilo no son perfectos, pero siguen siendo un medio importante para controlar la eficiencia de acoplamiento, y espero que los fabricantes de instrumentos a tratar de mejorar la precisión y la facilidad con la que estos métodos de trabajo. Mientras tanto, los detectores automáticos son mejor que nada, y grandes instalaciones centrales deben considerarlos como un método sencillo para el control diario de su desempeño sintetizador. El uso de ácido dicloroacético para Destritilación Despurinización (escisión del enlace glicósido) en condiciones ácidas es una reacción secundaria importante que limita cómo oligonucleótidos pueden ser sintetizados y así una gran cantidad de trabajo ha ido a encontrar las condiciones óptimas para la destritilación. Originalmente, fuertes ácidos próticos tales como ácido bencenosulfónico (pKa = 0,5) o ácido tricloroacético (TCA, pKa = 0,7) fueron utilizados. Sin embargo, en 1983, dos grupos independientemente encontrado que cuando el vidrio de poro controlado (CPG) fue utilizado como el soporte en fase sólida de un ácido débil, el ácido dicloroacético (DCA, pKa = 1,48), podría ser empleado satisfactoriamente (7, 8). De hecho, cuando se combina con la química de la fosforamidita esta combinación permite la síntesis de un oligonucleótido de base 5l larga, una longitud mucho mayor que cualquier cosa intentado anteriormente en ese momento. DCA es también más estable frente a la descomposición de ácido clorhídrico de TCA (9). Desde entonces, el DCA ha sido considerado como el mejor reactivo para la destritilación, y publicaciones que usa este ácido en concentraciones de 1% o bien (10), 2% (11), 2,4% (12), 3% (13), o 5 % (14) (v / v), ya sea en diclorometano (DCM) o 1,2-dicloroetano (DCE) han aparecido en la literatura. Este ácido también se utiliza comercialmente en Milligen / Biosearch, Pharmacia (1,3 escala mmol), y Applied Biosystems 390Z (a gran escala) sintetizadores de ADN (15). Aunque TCA puede causar la despurinación sustancial en oligonucleótidos enlazados de sílice (3% de TCA / DCM puede causar 12-67% despurinización en 1 hora, dependiendo de la posición de la desoxiadenosina) (16), este reactivo no ha dejado de ser vendido para uso en Applied Biosystems Beckman y sintetizadores. Obviamente, los muchos millones de oligonucleótidos satisfactorios que se han hecho con TCA son prueba de que este reactivo es adecuado para la mayoría de las síntesis. Sin embargo, cuando nuestro laboratorio comenzó a hacer oligonucleótidos más largos (80-150 bases), así como grandes síntesis escala (10-15 mmol), se encontró que muchos mejores resultados se obtuvieron con DCA en lugar de TCA (datos no mostrados), y ahora nos utilizan las soluciones de DCA para todos nuestros síntesis. Además de despurinización reducida, soluciones DCA también son más convenientemente preparados que las soluciones de TCA porque DCA es un líquido en lugar de un sólido (simplemente se añade el ácido líquido directamente a una botella de disolvente 41 y el filtro). En nuestro laboratorio se utiliza un 5% (v / v) DCA / DCE para cualquier secuencia de hasta aproximadamente 40 bases de largo y sólo 2% (v / v) DCA / DCE para secuencias más largas. No es necesario aumentar el tiempo total para la etapa de destritilación (que suele ser de unos 50-60 segundos) debido a que el ácido más débil, pero encontramos que es necesario para compensar la menor velocidad de flujo del disolvente DCE (DCE es más viscoso que DCM). Esto se puede hacer fácilmente mediante la ampliación del tiempo de entrega del reactivo a la columna de modo que suficiente reactivo llega a la columna de síntesis. Por lo general, el tiempo total de destritilación se puede mantener constante mediante la disminución ningún paso de espera en la destritilación. Nosotros preferimos utilizar DCE como disolvente, ya que produce menos despurinación, es menos tóxico, y dura casi el doble de tiempo en el sintetizador debido al menor volumen consumido por ciclo. La combinación DCA / DCE también parece compatible con el detector de conductividad AutoAnalysis Applied Biosystems (DCE también debe ser usado en posición 19), pero no hemos tratado de verificar la exactitud de los resultados obtenidos con esta combinación de reactivos. Use Low Cargando CPG para oligonucleótidos largos La síntesis de largos (50-150 bases) oligonucleótidos puede ser mejorado mediante el uso de un soporte de CPG (17) con una carga mucho menor (aproximadamente 5 mmol / g) que la habitual 30-40 mmol / g de carga. El tamaño de poros del soporte debe ser también l, 000 A o superior. CPG compatible con tamaños de poro superiores a 1.000 A están disponibles, pero siempre hemos tenido buenos resultados (en el rango de 50-150 base de largo) con 1.000 por soportes. Por lo general, paquete de la mano alrededor de 20 mg (0,1 mmol (aproximadamente 5 mmol / g)) de estos soportes en una columna de síntesis, pero dos veces tanto como se puede exprimir en una columna de síntesis estándar, si es necesario. La síntesis se realizó mediante nuestro estándar 0,2 mmol escala ciclo de síntesis con 2% de ácido dicloroacético / dicloroetano como reactivo destritilación y sin otras modificaciones. Creemos que la carga de superficie inferior del soporte da rendimientos de acoplamiento mucho más consistente, quizás debido a la sobrepoblación superficie inferior o simplemente el mayor exceso de reactivo presente. Estos oligonucleótidos largos se purificó usando una 40 cm de Bio-Rad Sequi-Gen secuenciación aparato de gel, que ha sido modificado con espaciadores 1,5 mm de espesor y los peines (a medida en nuestra tienda de la máquina). Este aparato permite que 12% en geles de urea polyacrylamide/7M desnaturalizantes que se ejecute en 55 °. El producto de longitud completa, que es la más fuerte banda en el gel, se identifica fácilmente por oscurecimiento de UV, y puede ser cortado, extraído y desalado de la forma habitual. Haga largo secuencias degeneradas con bases premezcladas Los recientes avances en combinatoria o "irracional" diseño de fármacos requieren grandes grupos de secuencias al azar de secuencias específicas que pueden ser recuperados (18). Típicamente estas piscinas constan de oligonucleótidos muy largas que contienen muchos sitios degenerados (es decir, 50-100 consecutivos posiciones degeneradas). La mayoría de los sintetizadores puede ser programado para mezclar bases degeneradas en línea, pero se ha encontrado que contienen secuencias largas extensiones de sitios degenerados puede ser mejorada significativamente por manualmente mezclando volúmenes iguales de las cuatro soluciones diferentes fosforamidita juntos y colocar esta mezcla en una posición de la base de repuesto . Un reactivo de base mixta también se puede hacer pesando las porciones de las fosforamiditas sólidos, pero los diferentes pesos moleculares de cada base (dA, 858; dG, 840; dC, 833; T, 744) se debe considerar para obtener cantidades equimolares. La premezcla se asegura de que los productos degeneradas creadas tienen una distribución de base más uniforme que la creada por automático base de mezcla en línea (19). Cuando un gran número de bases degeneradas se mezclan automáticamente, la cantidad de producto de longitud completa que pueden ser identificados en un gel se reduce enormemente, a menudo hasta el punto de que ningún producto se puede encontrar por oscurecimiento de UV. Sin embargo, las bases de premezcla produce productos de calidad similar a las secuencias no degeneradas que hacemos (datos no mostrados). Esto se debe a la eficiencia del acoplamiento es ligeramente menor cuando cinco botellas entregar los reactivos a la columna (cuatro bases más tetrazol) que cuando sólo se utilizan dos botellas. Aparentemente, la disminución de acoplamiento es tan pequeña que sólo las secuencias con un número muy grande de degeneraciones se ven afectados, por lo que la mezcla automática todavía produce buenos resultados, para abreviar, oligonucleótidos degenerados. Sin embargo, cuando largas secuencias aleatorias se requieren, mezclado manual permitirá a los oligonucleótidos para ser producido en mayores rendimientos globales, y el número de secuencias en la piscina azar se incrementará. Utilice acetonitrilo anhidro Buena Calidad para disolver fosforamiditas y tetrazol Laboratorios en lugares húmedos o que manualmente disolver su fosforamidita o reactivos tetrazol debe considerar la creación de su propio acetonitrilo todavía para que una fuente de disolvente seco está siempre disponible. Acetonitrilo anhidro disponible comercialmente es bueno cuando se abrió originalmente, pero repitió el muestreo o el almacenamiento prolongado de los frascos abiertos pueden introducir contaminación por humedad. Cantidades traza de humedad disminuyen la concentración eficaz de fosforamidita (20) y por lo tanto la eficiencia de acoplamiento. Por lo tanto, la calidad de acetonitrilo anhidro utilizado para disolver fosforamiditas es muy importante. Un aparato sencillo repurificación disolvente que consiste en un matraz de tres bocas, una pieza de cabeza de destilación / depósito (1.000 ml) y un condensador, se puede obtener comercialmente o de cualquier tienda de soplado de vidrio. Nosotros usamos una proporción relativamente grande todavía porque también preparamos nuestras propias soluciones tetrazol anhidras. Los laboratorios sólo requiere disolvente para disolver amiditas puede utilizar un aparato mucho más pequeño. Lo mejor es usar sólo acetonitrilo anhidro sobrante en el todavía porque este material tiene ya un contenido de agua muy bajo. La eliminación de grandes cantidades de humedad a partir de acetonitrilo requiere un proceso de destilación en dos etapas, una vez a partir de pentóxido de fósforo y una vez a partir de hidruro de calcio y es mucho más engorroso. Sin embargo, una continua simple reflujo sobre hidruro de calcio y bajo nitrógeno es suficiente para mantener el disolvente anhidro. Una sola llave de tres vías cambia la cabeza de reflujo todavía en el modo de recogida, y disolvente anhidro se puede prescindir fácilmente. Todo el aparato ocupa poco espacio y prácticamente no requiere mantenimiento. Nos rellenar el depósito con acetonitrilo sobrante cada par de semanas, y una vez o dos veces al año que vaciar el aparato para eliminar el exceso de hidruro de calcio y cualquier impureza que pueda poco a poco han acumulado. Este aparato es menos costosa que la compra botellas pequeñas de acetonitrilo anhidro, y fresco disolvente anhidro está disponible en todo momento. Utilice todas las jeringas de plástico para dispensar, transferencia y soluciones de filtrado Las jeringas desechables son muy convenientes para transferir pequeñas cantidades de reactivos. Sin embargo, la mayoría de las jeringas contienen una punta de caucho negro en el extremo del émbolo que no es resistente a disolventes orgánicos, y el contacto con acetonitrilo o THF se "congelará" el émbolo en su lugar. Este problema se puede evitar mediante el uso de todas las jeringas de plástico (disponible en Aldrich o Sigma en tamaños de 1 a 50 ml) que se hacen sólo de polipropileno y polietileno. Estos son ideales para disolver fosforamiditas y para transferir soluciones fosforamidita de una botella a otra (recuerde usar gafas de seguridad). A pesar de las jeringas se venden como artículos estériles, envasadas individualmente, son baratos como para ser considerados como artículos desechables y no tratar de volver a utilizarlos. Si se les trata como un solo uso, creemos que no son necesarias precauciones especiales de secado son necesarios debido a las jeringuillas estériles estén limpios y libres de humedad. Una jeringa de vacío lleno con un agente de secado ("Drierite") hace un orificio de ventilación conveniente para transferencias solución y evita la exposición a la humedad atmosférica. Auto-sellante de silicona blanca tabiques de caucho (disponible de Aldrich) también hacen tapas convenientes para cualquier reactivos sobrantes, ya que no se requieren sellos de aluminio. Pequeñas cantidades de reactivo también se puede filtrar fácilmente sin exposición a la humedad mediante el uso de estos filtros de jeringa de jeringas y fácilmente disponibles, siempre y cuando las unidades de filtro son compatibles con los disolventes (es decir, evitar los equipos con componentes de poliestireno o celulosa). PCR se puede utilizar para aislar oligonucleótidos muy larga Oligonucleótidos muy largos a veces se pueden sintetizar si se usa la PCR para amplificar el producto de longitud completa a partir de la mezcla de reacción compleja que se produce. En nuestro laboratorio se han obtenido con éxito las secuencias de 250 bases de longitud de esta manera, y existen ejemplos en la literatura de las secuencias en el intervalo de 300-600 bases siendo obtenidos (21). Verifique la presencia de grupos 5'-amino-o 5'-biotina Los oligonucleótidos que contienen 5'-amino o grupos 5'-biotina son necesarios para muchas aplicaciones que implican la detección no isotópica. La incorporación con éxito de estos grupos terminales es esencial para su función, pero no hay ninguna manera sencilla de verificar la presencia de estos grupos por cualquiera de los análisis de tritilo (reactivos Aminolink carecen de un grupo tritilo, y reactivos de biotina tienen una tasa mucho más lenta de destritilación), electroforesis o cromatografía. Esta dificultad se agrava por el hecho de que los reactivos modificadores de extremo generalmente no se utiliza con frecuencia y son a menudo de menor calidad (en términos de rendimiento de acoplamiento) de las fosforamiditas más comunes. Los reactivos son también mucho más caro. Afortunadamente, la presencia de estos grupos se puede determinar rápidamente utilizando cualquiera de ninhidrina o 4-dimetilamino- cinamaldehído (22) reactivos de pulverización. Esta prueba se realiza mediante el uso de un pequeño vaso capilar, dibujado a una punta fina en un mechero Bunsen, de detectar sobre ml l de muestra (aproximadamente 0, l-0,5 ODU) en una placa de TLC. La placa de TLC se utiliza solamente porque es un sustrato conveniente (se utilizan los mismos fluorescentes de sílice recubiertas hojas de TLC de plástico que utilizamos para oscurecimiento de UV), y otros sustratos también podría ser adecuado. La muestra se pulveriza a continuación, ya sea con ninhidrina (0,2% en etanol) o 4-dimetilaminocinamaldehido (1:1 mezcla de 2% de H2SO4 en etanol y 0,2% pDACA / etanol). La placa se calienta después usando un secador de pelo para desarrollar el color. Ninhidrina produce manchas azules oscuros si los grupos amino están presentes, y las formas de 4 dimetilaminocinamaldehido rosado- púrpura cuando biotina está presente. Aunque estos son sólo ensayos cualitativos, se puede determinar si o no una modificación 5 'está presente. Esto es particularmente importante cuando la síntesis de post-reacciones de derivatización fallan, y es necesario para determinar si el oligonucleótido o el reactivo de derivatización (ly típico de un éster de NHS) está en falta. También son convenientes para verificar que el producto correcto ha sido aislado, cuando síntesis produce más de un producto principal (por ejemplo, de pobre acoplamientos o estructura secundaria). Referencias R. T. Pon, Usman N., y K.K. Ogilvie, 1988, derivatización de perlas de vidrio de poro controlado de fase sólida oligonucleo marea síntesis, Biotechniques 6, 768-775. C. McCollum y Andrus A., 1991, un soporte de poliestireno optimizado para la síntesis rápida, eficiente oligonucleótido, Tetrahedron Letters 32, 4069-4072. J. Kaufman, Le M., G. Ross, P. Hing, Budiansky M., Yu E., E. Campbell, V. 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Ella continúa: "El color se desarrolla todo el camino a través de la fruta, que podría sorprender a los consumidores acostumbrados a las frutas supermercado con el color sobre todo en la superficie", dijo Weber. "Y dejar que la fruta madure en la planta sólo hace que las bayas dulces." ¿Te das cuenta todo lo que esto significa? Lo cambia todo. Púrpura pastel de fresas. Purple daiquiris de fresa. Extracción de ADN Purple! Sólo hay un inconveniente: no será capaz de pasarme por su tienda local y recoger un par de libras de Purple Wonder cuando le apetezca. Cornell se presenta la patente de la planta, y tiene un acuerdo de licencia en exclusiva con una empresa de semillas con el nombre de Burpee. En otras palabras, usted tendrá que comprar las semillas y hacer crecer su propia cuenta, el camino a Wonderdom Purple comienza en tu propio jardín. fuente Fresas Genética ácido lisérgico y el ADN DNA/RNA Synthesizers 11/27/12 ETH 101 Profesor Rollins Leyes inmutables puesto sobre la libertad * En relación con el principio supremo de la moralidad que todos la libertad de pensamiento o de acción han de ser gobernado bajo si se decide seguir un camino verdaderamente bueno. El principio supremo de la moral es la autonomía de la voluntad, de acuerdo con Kant, que explica como "Elija siempre de tal manera que en la voluntad misma de las máximas de la elección son al mismo tiempo presente como ley universal." (Kant, 44) lo que significa esencialmente ser tan bueno que nadie podría cuestionar carnero castrado su carácter es de respaldo moral de acuerdo con anyones moral respaldo local, aunque los que puede tener fallas, como veremos. theese son las leyes inmutables impuestas a la libertad, en virtud del cual se puede exersixe su voluntad sobre la libertad. * Con esto como nuestro apoyo vamos a contemplar la vida más libre y verdaderamente moral. Kamt cree que todas las personas con una conciencia moral está dotada de una "voluntad", y esta "voluntad" es lo que determina la "acción bajo la idea de su propia libertad." (Kant, 51), esto lleva a hacer cualquier cosa que quieras que sea verdaderamente moral más allá de las normas morales creados por las fuentes locales circundantes. un deseo o strivingto hacerlo es venerable incluso piadosamente en que esto no es más que el promedio de todos los extremos morales en un código moral Truist. es una abstracción de la verdadera moralidad desde el interior. Es intrínseco, pero aún así aceptó en su totalidad. Uno se pregunta cómo alguien puede ver tan blanco y negro desde el principio sin ninguna influencia externa. ¿qué hay de los niños salvajes y los huérfanos falta estimulación que ni siquiera saben lo que se siente al pensar o sentir realmente porque nunca han interactuado en ese nivel. ¿dónde sus sanciones morales ocurrido? las personas que los alimentan sin conversación? los animales de caza silvestre a un niño o es perseguido por el camino? si un caso de la vida humana que viene aproximadamente con un carácter intrínsecamente verdaderamente moral de dicha norma a partir de situaciones que se describen con el que se crían / ??planteado, dejaría ninguna duda de que los seres humanos son inherentemente bueno. Algunas casas de acogida ni siquiera esta digna de una norma. Algunas casas son inherentemente malas viviendas. ¿Cuál es entonces cuando alguien de un juicio moral y el carácter verdaderamente bueno se cría desde un comienzo, el cambio de los mismos sólo se sabe que forma con el fin de hacer lo que es correcto a quien mejor se lo enseñó a ser de otra manera inmoral. Tal concepto es posible, pero no siempre es fácil de maintianed a menos que su fuerza de voluntad es más fuerte que años de refuerzo. Esta es una pregunta de los propios voluntad, no de la moral. A todos nos enseñaron a ser como somos el problema, sigue siendo lo correcto que se ve que cuando elegimos lo que nos dejamos influir por. * Otro concepto que al estudiarse más a fondo está casi en parrallel de la idea principal que nos ocupa es: "el concepto de una voluntad incondicional buen Eso es absolutamente bueno que no puede ser malo, es decir, cuya máxima, cuando se convierte en un universal. ley, no puede entrar en conflicto con sí mismo. "(Kant, 42) esto significa que si usted aplica cualquiera de los attributesof dicha persona a todo el mundo dentro de una población, no se destruyen a sí mismos. el mundo lo hace mantener la capacidad de ser un lugar donde todos actúan de acuerdo con lo que es universalmente correcto y verdadero y honorable, pero ¿por qué es este mundo que no esté conforme a la virtud? Sólo porque cuando todo es posible así es su falta o lo contrario se hacen posibles. * El hecho de que usted es libre, si usted es moral, entonces usted sabe que esto es cierto: "Hay libertad tanto no es alojaríamos sin ley" (Kant, 49) esto es para decir que la moral de convertirse en seres equiparar los factores que definen los actiions. Esto es cierto alojaríamos y mientras uno puede ser intrínsecamente dentro de los límites morales sólo entonces puede uno prescribeto la libertad de ser una excepción de donde vinieron. Si hubieran éticamente se liberaron de la askewed sabor del medio ambiente fundación. * Tener un respaldo incuestionable intrínsecamente moral donde su educación moral no es original alojaríamos imposible. la propia idea tan inspira a hacer cambios para mejor en todo y todas las empresas favorables. Si este es sólo un resultado de la naturaleza humana es de beneficio. ¿existen otros más allá de que discutir. ¿por qué hay tantas almas prevailant moralmente curropt en casi cualquier población dada. Tales respuestas serían de debate y por lo tanto buscan las estadísticas de población sobre el tema sería de beneficio, pero manteniendo la regla de oro de la moralidad. La libertad es virtueous sólo mientras usted es una persona de la virtud moral. muert0 muert0 muert0 muert0 muert06 muert05 muert04 muert03 muert02 muert01 muert00 /////////////////////muy bueno muchas portas!!!\\\\\\\\\\\\'OR x=x?? muert00muert00 muert00 muert00 muert00 muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00muert00 muert00muert00muert00muert00muert00muert00 muert00 ®È§ ±_Ìñ_þèàÇè_¥¤_HÈÀ¥èñ§ ®È§±_Ìñ_þèàÇè_¥¤_HÈÀ ¥èñ§ bonita kendita ®È§±_Ìñ_þèàÇè_¥¤_HÈÀ ¥èñ§ ®È§±_Ìñ_þèàÇè_¥¤_HÈÀ ¥èñ§ ®È§±_Ìñ_þèàÇè_¥¤_HÈÀ ¥èñ§ ®È§±_Ìñ_þèàÇè_¥¤_HÈÀ ¥èñ§ ®È§ ±_Ìñ_þèàÇè_¥¤_HÈÀ¥èñ§ ®È§ ±_Ìñ_þèàÇè_¥¤_HÈÀ¥èñ§ ®È§±_Ìñ_þèàÇè_¥¤_HÈÀ¥èñ§ ®È§ ±_Ìñ_þèàÇè_¥¤_HÈÀ¥èñ§ free image hosting términos legales This free website was made using Yola. No HTML skills required. Build your website in minutes. Go to www.yola.com and sign up today! 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